Laporan Praktikum Tentang PCR

BAB I

PENDAHULUAN

LATAR BELAKANG

PCR adalah suatu metode perbanyakan DNA secara enzimatik sehingga DNA yang diperoleh dapat digunakan untuk analisis/penelitian. DNA yang jumlahnya sangat kecil, misalnya beberapa folikel rambut juga dapat dikarakterisasi dengan metode ini. Penemuan PCR pada tahun 1986 merupakan suatu langkah revolusi dalam bidang biokimia molekuler dan rekayasa genetika. Saat ini PCR sudah digunakan secara meluas pada kedokteran forensic, diagnosis genetika dan mikrobiologis serta manipulasi dan rekayasa gen. Selain itu teknik ini juga dapat digunakan untuk menganalisis penyaki Duchenne’s muscular dystrophy,hemofilia A, untuk mendeteksi limfoma sel T padamanusis, huma immunodeficiency virus (HIV), virus hepatitis B dan retinoblastoma, sertauntuk membuat DNA mutan dengan situs mutasi yang spesifik. Teknik ini banyak digunakan baik untuk penelitian maupun diagnosa klinik karena cukup spesifik, efisien dan memiliki derajat keberhasilan yang tinggi.Istilah ‘reaksi berantai’ digunakan karena perpanjangan rantai DNA dilakukan dalam siklus yang berulang-ulang (25 hingga 30 siklus). Yang diperlukan pada reaksiPCR adalah suatu DNA sasaran yang akan diamplifikasi, sepasang oligonukleotida primer yang masing-masing komplementer dengan ujung 3’ dari salah satu untai DNA sasaran, deoksinukleotida trifosfat (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) dan suatu enzim DNA polymerase yang tahan terhadap pemanasan tinggi (dikenal sebagaiTag polymerase). Taq polymerase berasal dari bakteri, Thermus aquaticus, yang dapat tumbuh dalamsumber air panas bersuhu 100° C atau lebih. Komponen-komponen dari reaksi PCR diinkubasi di dalam suatu mesin yangdapat mengatur perubahan suhu secara tepat (dikenal sebagai thermal cycler)

Perbanyakan molekul DNA tidak hanya dapat dilakukan dengan memanfaatkan mekanisme kehidupan mikroorganismes seperti dijelaskan pada bab sebelumnya (cloning DNA). Menggandakan jumlah molekul DNA dapat juga dilakukan melalui teknik PCR (Polymerase Chain Reaction).

PCR merupakan suatu reaksi in vitro untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target tersebut melalui bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer dalam suatuthermocyler. Panjang target DNA berkisar antara puluhan sampai ribuan nukleotida yang posisinya diapit sepasang primer. Primer yang berada sebelum daerah target disebut sebagai primer forward dan yang berada setelah daerah target disebut target disebut primer reverse. Enzim yang digunakan sebagai pencetak rangkaian molekul DNA baru dikenal sebagai enzimpolymerase. Untuk dapat mencetak rangkaian tersebut dalam teknik PCR, diperlukan juga dNTPs yang mencakkisarup dATP (nukleotida berbasa Adenine), dCTP (Cytosine), dGTP (Guanine) dan dTTP (Thymine).

Secara ringkas, prinsip pelipatgandaan jumlah molekul DNA pada target yang diinginkan melalui teknik PCR dapat dijelaskan sebagai berikut. Pada suhu 95°C, molekul DNA mengalami denaturasi sehingga strukturnya berubah dari untai ganda menjadi untai tunggal. Pada suhu berkisar antara (biasanya) 50°C sampai dengan 60°C, primer forward yang runutan nukleotidanya berkomplemen dengan salah satu untai tunggal akan menempel pada komposisi komplemennya. Demikian juga primer reversenya akan menempel pada untai tunggal lainnya. Setelah kedua primer tersebut menempel pada posisinya masing-masing, enzim polymerase mulai mensintesis molekul DNA baru yang dimulai dari ujung 3’nya masing-masing primer. Sintesa molekul DNA baru terjadi pada suhu 72°C. Proses ini juga disebut ekstensi. Dengan demikian, satu molekul DNA ganda akan berlipat jumlahnya menjadi dua molekul DNA. Setelah itu, diulang lagi proses.

TINJAUAN PUSTAKA

Tentu Anda sudah mengenal yang namanya DNA. DNA ini sering disebut-sebut terutama berkaitan dengan kriminalitas, diagnosa penyakit, penentuan ‘keabsahan’ keturunan, dll. Mungkin Anda bingung bagaimana caranya polisi bisa mengungkap pelaku kejahatan dengan berbekal sehelai rambut pelaku yang tercecer di TKP, atau dari tetesan sperma pemerkosa yang mengering di tubuh korban. Padahal kan sampel yang dianalisa jumlahnya sangat sedikit, ajaib!

Ternyata hal ini gak lepas dari yang namanya PCR alias Polymerase Chain Reaction. Proses yang berlangsung secara in vitro dalam tabung reaksi sebesar 200 µl ini mampu menggandakan atau mengkopi DNA hingga miliaran kali jumlah semula. Maka pantes aja dengan berbekal DNA yang terkandung dalam sampel yang cuma secuil itu bisa diperoleh banyak sekali informasi sesuai kebutuhan kita.

Reaksi PCR meniru reaksi penggandaan atau replikasi DNA yang terjadi dalam makhluk hidup. Secara sederhana PCR merupakan reaksi penggandaan daerah tertentu dari DNA cetakan (template) dengan batuan enzim DNA polymerase.

PCR terdiri atas beberapa siklus yang berulang-ulang, biasanya 20 sampai 40 siklus. Nah, sekarang bayangkan bahwa pada setiap siklus DNA polymerase akan menggandakan DNA sebanyak 2 kali, dan coba hitung berapa salinan utas ganda DNA yang akan dihasilkan setelah 30 siklus? Yup, 2 pangkat 30 alias 1.073.741.824 kali! Tentu saja nilainya tidak tepat seperti itu, kita masih harus memperhitungkan efisiensi reaksi, tapi tetap saja hasilnya akan sangat banyak.

Sumber: http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcrcopies.gif

Komponen PCR

Selain DNA template yang akan digandakan dan enzim DNA polymerase, komponen lain yang dibutuhkan adalah:

Primer

Primer adalah sepasang DNA utas tunggal atau oligonukleotida pendek yang menginisiasi sekaligus membatasi reaksi pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA. Jadi jangan membayangkan kalau PCR mampu menggandakan seluruh DNA bakteri E. coli yang panjangnya kira-kira 3 juta bp itu. PCR hanya mampu menggandakan DNA pada daerah tertentu sepanjang maksimum 10000 bp saja, dan dengan teknik tertentu bisa sampai 40000 bp. Primer dirancang untuk memiliki sekuen yang komplemen dengan DNA template, jadi dirancang agar menempel mengapit daerah tertentu yang kita inginkan.

dNTP (deoxynucleoside triphosphate)

dNTP alias building blocks sebagai ‘batu bata’ penyusun DNA yang baru. dNTP terdiri atas 4 macam sesuai dengan basa penyusun DNA, yaitu dATP, dCTP, dGTP dan dTTP.

Buffer

Buffer yang biasanya terdiri atas bahan-bahan kimia untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan enzim DNA polymerase.

Ion Logam

• Ion logam bivalen, umumnya Mg++, fungsinya sebagai kofaktor bagi enzim DNA polymerase. Tanpa ion ini enzim DNA polymerase tidak dapat bekerja.
• Ion logam monovalen, kalsium (K+).

Tahapan Reaksi

Sumber: http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcrsteps.gif

Setiap siklus reaksi PCR terdiri atas tiga tahap, yaitu:

Denaturasi

Denaturasi dilakukan dengan pemanasan hingga 96oC selama 30-60 detik. Pada suhu ini DNA utas ganda akan memisah menjadi utas tunggal.

Annealing

Setelah DNA menjadi utas tunggal, suhu diturukan ke kisaran 40-60oC selama 20-40 detik untuk memberikan kesempatan bagi primer untuk menempel pada DNA template di tempat yang komplemen dengan sekuen primer.

Ekstensi/elongasi

Dilakukan dengan menaikkan suhu ke kisaran suhu kerja optimum enzim DNA polymerase, biasanya 70-72oC. Pada tahap ini DNA polymerase akan memasangkan dNTP yang sesuai pada pasangannya, jika basa pada template adalah A, maka akan dipasang dNTP, begitu seterusnya (ingat pasangan A adalah T, dan C dengan G, begitu pula sebaliknya). Enzim akan memperpanjang rantai baru ini hingga ke ujung. Lamanya waktu ekstensi bergantung pada panjang daerah yang akan diamplifikasi, secara kasarnya adalah 1 menit untuk setiap 1000 bp.

Selain ketiga proses tersebut biasanya PCR didahului dan diakhiri oleh tahapan berikut:

Pra-denaturasi

Dilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk memastikan kesempurnaan denaturasi dan mengaktifasi DNA Polymerase (jenis hot-start alias baru aktif kalau dipanaskan terlebih dahulu).

Final Elongasi

Biasanya dilakukan pada suhu optimum enzim (70-72oC) selama 5-15 menit untuk memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah diperpanjang secara sempurna. Proses ini dilakukan setelah siklus PCR terakhir

PCR dilakukan dengan menggunakan mesin Thermal Cycler yang dapat menaikkan dan menurunkan suhu dalam waktu cepat sesuai kebutuhan siklus PCR. Pada awalnya orang menggunakan tiga penangas air (water bath) untuk melakukan denaturasi, annealing dan ekstensi secara manual, berpindah dari satu suhu ke suhu lainnya menggunakan tangan. Tapi syukurlah sekarang mesin Thermal Cycler sudah terotomatisasi dan dapat diprogram sesuai kebutuhan.

Aplikasi teknik PCR

Kita harus berterima kasih kepada Kary B Mullis yang telah menemukan dan mengaplikasikan PCR pada tahun 1984. Saat ini PCR sudah digunakan secara luas untuk berbagai macam kebutuhan, diantaranya:

Isolasi Gen

Kita tahu bahwa DNA makhluk hidup memiliki ukuran yang sangat besar, DNA manusia saja panjangnya sekitar 3 miliar basa, dan di dalamnya mengandung ribuan gen. Oh ya, gen itu apaan ya?

Sebagaimana kita tahu bahwa fungsi utama DNA adalah sebagai sandi genetik, yaitu sebagai panduan sel dalam memproduksi protein, DNA ditranskrip menghasilkan RNA, RNA kemudian diterjemahkan untuk menghasilkan rantai asam amino alias protein. Dari sekian panjang DNA genome, bagian yang menyandikan protein inilah yang disebut gen, sisanya tidak menyandikan protein atau disebut ‘junk DNA’, DNA ‘sampah’ yang fungsinya belum diketahui dengan baik.

Kembali ke pembahasan isolasi gen, para ahli seringkali membutuhkan gen tertentu untuk diisolasi. Sebagai contoh, dulu kita harus mengekstrak insulin langsung dari pancreas sapi atau babi, kemudian menjadikannya obat diabetes, proses yang rumit dan tentu saja mahal serta memiliki efek samping karena insulin dari sapi atau babi tidak benar-benar sama dengan insulin manusia.

Berkat teknologi rekayasa genetik, kini mereka dapat mengisolasi gen penghasil insulin dari DNA genome manusia, lalu menyisipkannya ke sel bakteri (dalam hal ini E. coli) agar bakteri dapat memproduksi insulin juga [http://www.littletree.com.au/dna.htm]. Dan ajaib! Hasilnya insulin yang sama persis dengan yang dihasilkan dalam tubuh manusia, dan sekarang insulin tinggal diekstrak dari bakteri, lebih cepat, mudah, dan tentunya lebih murah ketimbang cara konvensional yang harus ‘mengorbankan’ sapi atau babi.

Nah, untuk mengisolasi gen, diperlukan DNA pencari atau dikenal dengan nama ‘probe’ yang memiliki urutan basa nukleotida sama dengan gen yang kita inginkan. Probe ini bisa dibuat dengan teknik PCR menggunakan primer yang sesuai dengan gen tersebut.

DNA Sequencing

Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA Sequencing, metode yang umum digunakan saat ini adalah metode Sanger (chain termination method) yang sudah dimodifikasi menggunakan dye-dideoxy terminator, dimana proses awalnya adalah reaksi PCR dengan pereaksi yang agak berbeda, yaitu hanya menggunakan satu primer (PCR biasa menggunakan 2 primer) dan adanya tambahan dideoxynucleotide yang dilabel fluorescent. Karena warna fluorescent untuk setiap basa berbeda, maka urutan basa suatu DNA yang tidak diketahui bisa ditentukan.

Forensik

Identifikasi seseorang yang terlibat kejahatan (baik pelaku maupun korban), atau korban kecelakaan/bencana kadang sulit dilakukan. Jika identifikasi secara fisik sulit atau tidak mungkin lagi dilakukan, maka pengujian DNA adalah pilihan yang tepat. DNA dapat diambil dari bagian tubuh manapun, kemudian dilakukan analisa PCR untuk mengamplifikasi bagian-bagian tertentu DNA yang disebut fingerprints alias DNA sidik jari, yaitu bagian yang unik bagi setiap orang. Hasilnya dibandingkan dengan DNA sidik jari keluarganya yang memiliki pertalian darah, misalnya ibu atau bapak kandung. Jika memiliki kecocokan yang sangat tinggi maka bisa dipastikan identitas orang yang dimaksud.

Konon banyak kalangan tertentu yang memanfaatkan pengujian ini untuk menelusuri orang tua ‘sesungguhnya’ dari seorang anak jika sang orang tua merasa ragu.

Diagnosa Penyakit

Penyakit Influenza A (H1N1) yang sebelumnya disebut flu babi sedang mewabah saat ini, bahkan satu fase lagi dari fase pandemi. Penyakit berbahaya seperti ini memerlukan diagnosa yang cepat dan akurat.

PCR merupakan teknik yang sering digunakan. Teknologi saat ini memungkinkan diagnosa dalam hitungan jam dengan hasil akurat. Disebut akurat karena PCR mengamplifikasi daerah tertentu DNA yang merupakan ciri khas virus Influenza A (H1N1) yang tidak dimiliki oleh virus atau makhluk lainnya.

Masih banyak aplikasi PCR lainnya yang sangat bermanfaat. Maka tak salah panitia Nobel menganugrahkan hadiah Nobel bidang kimia yang bergengsi ini kepada Kary B Mullis hanya 9 tahun setelah penemuannya (1993).

Sumber: Wikipedia, Andy Vierstraete dan sumber-sumber lainnya.

MATERI DAN METODE

Materi Praktikum

Alat-alat Praktikum

Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini yaitu :

1. Mesin PCR
2. Elektroforesis
3. Sinar UV (Ultra violet)
4. Microwave
5. Sisir gel
6. Micro pipet
7. Tabung Ependorf
8. Sarung Tangan
9. Tabung PCR
10. Parafilm
11. Timbangan Analitik
12. Erlenmeyer
13. Gelas Ukur
14. Cetakan Elektroforesis

Bahan-bahan Praktikum

Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum ini yaitu :

1. Air steril (Steril Water)           : 6,7 µl
2. 10 x buffer tag                                    : 1,0 µl
3. 2,5 mM dNTP mix                  : 0,4 µl
4. 10 µM primer forward            : 0,4 µl
5. 10 µM primer reverse              : 0,4 µl
6. Template                                 : 1,0 µl
7. Enzim                                      : 0,1 µl

Bahan-bahan praktikum (Elektroforesis Gel)

1.    Agarose

2.    Buffer TAE

3.    EtBr (Ethidium bromide)

Metode Praktikum

Adapun metode yang digunakan dalam praktikum ini yaitu :

a)      Mencampurkan Bahan-bahan

1.    Mengambil air steril (steril water) sebanyak 6,7 µl dengan menggunakan mikro pipet 25 µl dengan tip yang berbeda dan masukkan ke dalam tabung PCR.

2.    Mengambil buffer tag sebanyak 1 µl dengan mikro pipet 25 µl dengan tip yang berbeda dan masukkan ke dalam tabung PCR.

3.    Menambahkan dNTP mix sebanyak 0,4 µl dan sama perlakuannya seperti pada no 1 dan 2

4.    Menambahkan primer forward 0,4 µl dan sama perlakuannya seperti pada no 1 dan 2

5.    Menambahkan primer reverse 0,4 µl dan sama perlakuannya seperti pada no 1 dan 2

6.    Memasukkan template kedalam tabung PCR sebanyak 1,0 µl dan sama perlakuannya seperti pada no 1 dan 2

7.    Memasukkan enzim sebanyak 0,1µl dan sama perlakuannya seperti pada no 1 dan 2

8.    Menutup tabung PCR agar tidak terjadi kontaminasi terhadap mikroorganisme lain.

b)      Elektroforesis

1.    Memasukkan agarose ke dalam tabung erlenmeyer